猪链球菌的分离与鉴定

猪链球菌的分离与鉴定 发布时间： 2003-2-2 作者：朱凤才 杨华富 胡晓杼 汪华 王广和 宋亚军 杨瑞馥 2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。 关键词：猪链球菌 分离与鉴定 论文完成日期：2000年6月15日 目 录 摘要………………………………………………1 前言………………………………………………2 1. 试验材料……………………………………….2 2. 方法…………………………………………….2 2.1病原分离……………………………………..2 2.2分离菌株的鉴定……………………………..2 2.3致病力及保护力试验………………………..3 2.4药敏试验……………………………………..3 3.结果…………………………………………….4 3. 1分离菌的培养特性及形态特征….………….4 3.2生化试验结果………………………………..5 3.3血清学鉴定结果……………………………..5 3.4致病力试验及保护力试验结果……………..5 3.5细菌回收试验结果…………………………..5 3.6药敏试验结果………………………………..5 4分析与讨论…………………………………….6 参考文献…………………………………………7 猪链球菌的分离与鉴定 摘 要 2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。 关键词：猪链球菌 分离鉴定 前 言 猪链球菌（Streptococcosis suis）是猪的一种重要疾病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。 猪链球菌截止到目前已发现的荚膜型已超过30种[1]。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌在我国的存在 [2]。猪链球菌可致2—6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等[3-7]。病猪和带菌猪是本病的重要传染源，病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害处理的病死猪肉、内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，但以4—10月份发生较多。本病常为地方性流行性，多呈败血性。短期波及全群，如不进行防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染。 2000年4月，岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎及败血症，多为2—6周龄仔猪。无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。 1． 实验材料 1． 1病料 无菌采取岐山县种猪繁育场患关节炎病猪的关节液8份，编号为1—8号，无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，编号为9—16号。 1． 2试剂 试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，批号自95—98年不等。 1． 3培养基 绵羊鲜血平板、匹克氏增菌液、10ml/L猪血清肉汤及各种糖培养基按常规方法制备[8]。 1． 4血清学试验 猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原均购自中国兽药鉴察所，批号为990705。 1． 5药敏纸片 购自浙江省军区后勤部，批号20000312。 1． 6试验动物 健康小白鼠（30—35g）50只，购自第四军医大学实验动物中心。 2． 方法 2． 1 病原分离 将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后，分别接种鲜血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。 2．2 分离菌株的鉴定 2．2．1生化试验 随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37℃培养24h后，观察其对糖的利用情况。 2．2．2血清学鉴定 将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS制成 1*10 10~2*10 10细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。 2．3 致病力及保护力试验 2．3．1菌落形成单位的测定 按常规方法进行[9] 2．3．2致病力试验 无菌吸取上述血清肉汤培养物 （含菌量5.0*10 8CFU/ml）以0.1ml /只、0.2ml/只、 0.3ml/只、 0.4ml /只、0.5ml/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7 组。第一组，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二组每只注射8#菌0.2ml，第三组每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四组每只注射13#菌0.2ml，第五组每只注射15#菌0.2ml，第六组每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七组每只注射无菌血清肉汤1.0ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。 2．3．3保护力试验 将3#、8#、13#、15#血清肉汤培养物分别接种于18 cm鲜血平板。37℃培养24h后，收菌，用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用0.3%甲醛灭活；37℃作用24h；作无菌检验。然后分别腹部皮下接种小白鼠2只，0.4ml/ 只。10天后，再分别人工感染，0.2ml/只。 2．3．4细菌回收试验 对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。 2．4药敏试验 采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20—24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。 表 1 各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准 抗菌药物名称 抑菌圈直径（mm） 耐药 中度敏感 高度敏感 青霉素 土霉素 洁霉素 链霉素 庆大霉素 卡那霉素 头孢菌素<10 <10 <10 <10 <12 <12 <10 10~12 10~14 10~14 10~14 13~14 13~14 10~15 >13 >15 >15 >15 >15 >15 >15 3．结果 3．1分离细菌的培养特性及形态特征 3．1．1培养特性 37℃培养24h后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。 3．1．2染色特性 关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。 3．2生化试验结果（见表2） 表2 分离菌生化试验结果 鉴定 蔗糖 山梨 棉实 葡萄 甘露 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨 马尿 项目 醇 糖 糖 糖 苷 酸钠 3# + - - + + + + + + - 8# + - - + + + + + + - 13# + - - + + + + + + - 15# + - - + + + + + + - 判定标准：“+”表示大多数（90%—100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%—100%）菌株为阴性。 表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应