本文是一篇工程硕士论文，本研究从Cd污染土壤中筛选鉴定了功能菌株103，并对菌株的耐Cd特性进行了分析。通过水培实验分析了耐Cd芽孢杆菌102和103对印度芥菜生理指标及基因表达的影响。利用农田废弃物玉米秸秆制备的生物炭，构建了玉米生物炭与耐Cd芽孢杆菌102、103和超富集植物印度芥菜的联合修复体系。
1绪论
1.1土壤镉污染概述
1.1.1土壤镉污染现状
随着城市化、工业化进程加快，我国土壤重金属污染问题日益突出。2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》指出：耕地土壤点位超标率达19.4%，污染类型以无机型为主，其中以镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、铜（Cu）、铅（Pb）、铬（Cr）、锌（Zn）、镍（Ni）8种无机污染物为主[1]。重金属在土壤中具有毒性大、半衰期长等特性，土壤重金属会限制植物的生长和农产品质量[2]，并可通过食物链进入人体危害人体健康[3]，因此，保障土壤安全是保障食品安全的前提。
1.1.2土壤镉危害
Cd为重金属五毒之首[4]。Cd被植物吸收，通过食物链富集直接或间接被人体吸收，对人体健康存在安全隐患[5]。20世纪时，日本发生的“痛痛病”就是长期食用Cd大米和被Cd所污染的水源所导致的[6]。2013年，广东连续两次抽查中出现17个批次的Cd大米[7]。Cd通过食物被人体吸收后，大多数与血红细胞结合在红细胞中，极易积累在人体肾脏和肝脏中，过量积累会导致骨骼变软、形状发生变化、器官衰竭等疾病[8]。Cd在人体内会损伤血管，引发体内多系统的伤害。
此外，Cd并非植物所必需元素，被植物吸收后，会限制植物呼吸作用以及对水分的吸收[9]，导致植物生长缓慢，叶片变黄等现象[10]，抑制植物的光合作用和细胞分裂，诱导氧化应激的产生[11]，对植物酶活产生影响。
1.2微生物修复土壤重金属研究
采矿冶炼、化肥农药的过度使用、制造业等人为活动均可引发土壤重金属污染，已经成为危害人类健康和限制农业安全生产的重要环境问题[12–15]。目前，重金属修复主要分为物理修复、化学修复和生物修复。通过物理手段直接对土壤进行修复被称为物理修复，常见的方法如客土法和换土法等，通过加入干净的土，换掉污染土，以降低土壤重金属污染[16]。物理修复效率高，但同时也伴随着成本高和能耗高，并受到污染场地面积以及污染程度的影响[17]。化学修复是通过向土壤中添加化学改良剂，影响土壤pH值等环境条件，改变土壤中重金属的存在形态，降低重金属的生物可利用性[18]。生物修复主要包括微生物修复和植物修复，微生物修复是利用微生物对重金属的吸附累积、沉淀、生物代谢转化等作用将重金属转化为低毒物质，从而减少植物的吸收，降低重金属对环境污染的一种修复手段[19]。土壤中微生物种类繁多，目前研究中修复重金属的微生物大多为细菌和真菌（如表1-1所示）。
2镉胁迫下芽孢杆菌抗镉特性研究
2.2材料与方法
2.2.1实验土壤
土壤采集自四川省成都市某化工厂周边受Cd污染的土壤。先除去覆盖土壤表层的石块、落叶等杂物，采集距离地面10~20 cm深度的土壤样品3份，使用无菌袋保存待回实验室以备用。
2.2.2菌株分离筛选与鉴定
将土壤中石块等杂物去除，过2 mm尼龙筛备用。称取10 g已过筛的土壤样品，和90 ml无菌水混合存放于锥形瓶中，以30℃、180 rpm条件下振荡30 min。梯度稀释将菌悬液稀释为10-1、10-2和10-3，将稀释液分别涂布在Cd2+浓度为20 mg/L的LB固体培养基中，30℃在恒温培养箱中培养12~48 h，观察至长出单个菌落后，挑选单菌落接种至LB固体斜面培养基上培养并保存。LB固体培养基为：每100 ml中含有1g蛋白胨；1 g酵母浸粉；0.5 g氯化钠；琼脂添加量为1.8 g。
根据OMIGA试剂盒提取菌株DNA，进行PCR扩增鉴定。扩增步骤参考参考文献进行[94]。由深圳华大基因科技有限公司对PCR产物进行测序。
2.2.3产生长素吲哚乙酸（IAA）能力测定
将菌株接种至含有色氨酸浓度为200 mg/L的LB液体培养基中制备菌悬液，同时设置对照，分别为未接种菌株且未添加色氨酸的培养基和无菌液和含有色氨酸浓度的培养基作为对照。在30℃、150 rpm的条件下培养48 h，每隔12 h取样，离心留上清液备用。测定步骤按照吲哚乙酸试剂盒说明书进行操作。采用96孔板在波长为450 nm处进行测定。
2.3结果与分析
2.3.1菌株分离筛选与鉴定
从四川Cd污染土壤中筛选得到一菌株，该菌株可以在Cd2+浓度为200、500 mg/L的固体培养基中生长，涂布后梯度明显，菌群数量和Cd浓度成反比，Cd浓度越高，菌落数量越少，详见图2-1。
3 芽孢杆菌 102 对镉胁迫下印度芥菜的转录组分析 ........................ 19
3.1 引言 .............................. 19
3.2 材料与方法 .................... 19
4 芽孢杆菌 103 对镉胁迫下印度芥菜的转录组分析 ........................ 35
4.1 引言 .............................. 35
4.2 材料与方法 ....................... 35
5 生物炭基微生物菌剂-印度芥菜联合修复镉污染土壤 ..................... 51
5.1 引言 ............................ 51
5.2 材料与方法 ........................... 51
5生物炭基微生物菌剂-印度芥菜联合修复镉污染土壤
5.2材料与方法
5.2.1供试材料
印度芥菜种子采购同3.2.1。玉米生物炭从河南立泽环保科技有限公司购入。
土壤来自河南省新乡市某化工厂附近的Cd污染土壤。土壤理化性质如下：土壤pH为6.5，碱解氮56 mg/kg，有效磷37 mg/kg。
5.2.2实验设计
将400 g受Cd污染土壤过0.2 mm筛后装入实验盆（10 cm×10 cm），分别加入土壤质量为0%、3%、6%和9%的玉米生物炭，充分混匀之后每盆再加入1 g史丹利复合肥作为基肥与土壤混合，平衡10天，前7天加入少量水，后3天调节土壤水分为田间持水量60%并定时翻搅，避免种植时使植物烧苗。
微生物菌剂为102和103，添加量按照生物炭比例添加分别为3 ml、6 ml和9 ml菌悬液，在播种前加入，微生物于LB液体培养基中活化，在摇床上30℃、150 rmp培养5天，之后用蒸馏水稀释后接种于土壤中。
平衡过后播种印度芥菜种子，种子消毒同3.2.1播种方式采用直播，生长一周后间苗，每盆保留4株苗，每个处理设置3个重复，在人工培养箱内每天光照16 h，昼夜温度分别为24、20℃，培养60天之后采样进行测定。
结论
本研究从Cd污染土壤中筛选鉴定了功能菌株103，并对菌株的耐Cd特性进行了分析。通过水培实验分析了耐Cd芽孢杆菌102和103对印度芥菜生理指标及基因表达的影响。利用农田废弃物玉米秸秆制备的生物炭，构建了玉米生物炭与耐Cd芽孢杆菌102、103和超富集植物印度芥菜的联合修复体系。通过土培实验分析了生物炭基微生物菌剂对印度芥菜生理指标、Cd吸附及对土壤微生物多样性的影响，综合分析生物炭基微生物菌剂及印度芥菜对Cd污染土壤的联合修复情况。
本研究的主要结果如下：
（1）通过对菌株在Cd浓度下的生长发现，芽孢杆菌103可以在500 mg/L的固体培养基中生长。FTIR和SEM分析得出，细胞表面的官能团如多糖的羟基、羧基和蛋白质等参与了菌株对Cd的生物吸附过程。芽孢杆菌102和103生物吸附Cd后，细胞间出现絮状物，且细胞形态发生变化。芽孢杆菌102、103受到Cd胁迫后，通过改变细胞形态和产生分泌物来适应Cd的毒害。
（2）通过水培实验进行转录组测序，分析Cd胁迫下芽孢杆菌102对印度芥菜响应Cd胁迫的基因表达和生理指标变化。生理指标结果表明，芽孢杆菌102提高了印度芥菜抗氧化酶的活性。从转录组测序结果中共获得11,543个基因差异表达，分别被注释到6个数据库中。GO注释和KEGG富集结果表明，芽孢杆菌102通过调节多途径基因表达响应Cd胁迫。GO注释结果表明Cd胁迫下的差异表达基因为细胞过程、代谢过程和结合等方面。KEGG分析富集发现，差异表达基因的表达大多与植物激素、转运系统、转录因子和抗氧化酶等功能性基因有关。其中，显著上调的基因为生长素、抗氧化酶、转运系统、GST。结果表明芽孢杆菌102通过增加抗氧化酶活性、调节生长素、重金属转运和转录因子活性，促进植物生长，增强植物对Cd的耐受性。
参考文献（略）
