本文是一篇土木工程论文，本研究利用实验室已筛选的恩诺沙星低温降解菌-产碱杆菌（Alcaligenes），在研发固定化工艺基础上，制备一种抗冻融、耐低温的固定化菌剂，筛选明确该固定化菌剂高效降解恩诺沙星的最优环境条件，并评估冻融条件下固定化产碱杆菌对水体和土壤中恩诺沙星的降解效果，为我国北方冬季寒冷地区抗生素生物降解技术的构建提供支撑。
第1章 绪论
1.1喹诺酮类抗生素的概述
近年来，喹诺酮类抗生素由于抗菌活性强、生物利用度高、价格低廉，被广泛用畜禽的疾病治疗，我国喹诺酮类抗生素的消费量已占全球抗生素的17%[1-2]。常见的喹诺酮类抗生素包括恩诺沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、环丙沙星（CIP）等，它们通过抑制拓扑异构酶IV和DNA旋转酶的活性，达到更好的治疗效果和杀菌活性，所以被广泛引入[3]。值得一提的是，2020年中国兽药喹诺酮类抗生素的总使用量已高达966.58吨[4]。由于抗生素在动物体内通常不能被完全吸收或代谢，一部分抗生素以母体化合物或代谢物的形式不断地排泄到环境中。在过去十几年中，水体和土壤中已积累了大量抗生素，在严重污染的河流中，地表水中经常发现大量喹诺酮类抗生素残留，浓度在0.5~497.6 ng/L之间[5]。据报道，鸡粪中的诺氟沙星和恩诺沙星含量高于200 mg/kg[6]。畜禽粪便堆肥后作为有机肥使用，使得喹诺酮类抗生素在农田土壤中进入农田系统，浓度范围在48.8~10111.0 µg/kg[7]。抗生素的残留会造成可选择性地消除或抑制微生物，诱发生物的毒性反应，促进耐药菌的产生，对生态系统和人类健康带来显著的负面影响[8]。因此，如何高效持续修复抗生素污染介质已成为新污染物治理中的一个重要问题。
1.1.1喹诺酮类抗生素的污染危害
虽然抗生素在环境中的残留浓度仍处于微量水平，但由于新污染物通常是外源的，且具有高生物活性的物质，所以其对生态环境和公众健康的危害不容忽视。
首先，抗生素的残留会对环境产生一定的生态毒性作用，破坏生态系统的平衡[9]。Riaz等[10]在小麦萌发实验中研究了环丙沙星、恩诺沙星和左氧氟沙星及其混合物的短期毒性，发现高浓度的抗生素会影响培养基中植物的生长发育，削弱植物抵御氧化应激能力，破坏小麦幼苗的生理结构。
1.2抗生素的微生物降解
1.2.1微生物降解抗生素的研究进展
微生物作为自然界许多生化过程的参与者，在抗生素的生物降解过程中被证实起着主导作用[27]。微生物修复技术已被证实是一种比物理和化学修复更经济有效和更环保的方法[28]。Zhang等[29]研究发现，当恩诺沙星浓度分别为1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L和25 mg/L时，菌株GJEE142对恩诺沙星的去除分别可达到0.62 mg/L、3.91 mg/L、7.28 mg/L、10.08 mg/L、12.63 mg/L和12.91 mg/L。梅瀚杰等[30]筛选的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）在初始pH为5.8、温度为33.6 ℃时，对恩诺沙星的降解率最高，可以达到77.8%±0.53%。Dorival等[31]研究了水中6种喹诺酮类抗生素的去除过程，其中莫西沙星和环丙沙星的生物降解率最高，分别为47.2%和52.8%。Zhang等[32]通过土壤中环丙沙星的室内模拟降解实验得出，土壤中环丙沙星的微生物降解速率常数为0.039/d，初步鉴定出4种环丙沙星降解真菌：Penicillium、Aspergillus fumigatus、Penicillium normosum和Penicillium dilatatum。杨敏[33]筛选出一株命名为Microbacterium sp.QL的微杆菌，对初始浓度为100 mg/L的诺氟沙星的降解率可达45.6%。Selvam等[34]发现白腐真菌7 d内可降解约80%的氧氟沙星，且降解产物的毒性也很小，同时白腐真菌对诺氟沙星和环丙沙星也具有降解效果。
第2章 抗冻融固定化颗粒的制备与表征
2.1实验材料与方法
2.1.1仪器和设备
2.2结果与分析
2.2.1抗冻融固定化颗粒
为了使固定化颗粒能够具有更高的机械强度，并且具备抗冻融的能力，本研究对各个材料浓度设置了多个梯度。在实验中我们发现当海藻酸钠浓度低于1%时，颗粒不成形，高于3%时颗粒容易有拖尾的情况，综合成本等各方面因素决定将海藻酸钠的浓度选定在2.5%，在确保制备出光滑圆润的标准固定化颗粒前提下，确定了各成分浓度占比，分别为生物炭0.25%、沸石0.25%、焦磷酸钠3%、六偏磷酸钠1%、三聚磷酸钠3%，蔗糖2%。经观测，此类抗冻融固定化颗粒呈银白色光滑圆球状，每颗平均质量为（0.05±0.005）g，平均粒径为（3±0.1）mm，如图2.1所示。
2.2.2抗冻融固定化颗粒机械强度
从图2.3可以看出，加入了焦磷酸钠、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、蔗糖等抗冻剂材料的颗粒机械强度显著提高，可承受的最大压力值达到113.7 N，相对于纯海藻酸钠颗粒提高了156.7%。在本试验中，海藻酸钠浓度（2%~3%）越高制备的颗粒机械强度越高；加入沸石和生物炭复合材料的颗粒机械强度大于两种材料单一加入的颗粒。
第3章 环境因素对固定化菌剂降解恩诺沙星的影响 ........................ 23
3.1 实验材料与方法 ...................... 24
3.1.1 仪器和设备 ................................. 24
3.1.2 试剂与材料 ............................... 25
第4章 冻融条件下固定化菌剂对水体和土壤中恩诺沙星的降解 .... 36
4.1 实验材料与方法 ............................. 37
4.1.1 仪器和设备 .......................... 37
4.1.2 试剂与材料 .............................. 37
第5章 结论与展望 ..................... 46
第4章 冻融条件下固定化菌剂对水体和土壤中恩诺沙星的降解
4.1实验材料与方法
4.1.1仪器和设备
将Y菌以质量比为3%的占比投加到20 mL的LB培养基中，恩诺沙星的浓度设定为500 μg/L。设置Tck：空白对照、T1：Y菌菌悬液、T2：固定化颗粒、T3：固定化Y菌4个处理，设置不冻融处理的8 °C对照，每种处理做三个重复。-20 ℃冻24 h，8 ℃融24 h，为一个冻融循环。150 r/min避光条件下振荡培养15 d。分别在0d、冻融1次、冻融3次、冻融5次、冻融7次取样测定恩诺沙星含量。固定化产碱杆菌颗粒活化方法同（3.1.4.2）
第5章 结论与展望
针对北方寒冷地区冻融条件下抗生素降解效率低下问题，为进一步提升低温降解菌对环境的适应能力，增强其回收利用率和对污染物的去除效果，本研究利用实验室已筛选的恩诺沙星低温降解菌-产碱杆菌（Alcaligenes），在研发固定化工艺基础上，制备一种抗冻融、耐低温的固定化菌剂，筛选明确该固定化菌剂高效降解恩诺沙星的最优环境条件，并评估冻融条件下固定化产碱杆菌对水体和土壤中恩诺沙星的降解效果，为我国北方冬季寒冷地区抗生素生物降解技术的构建提供支撑。得出以下几个结论：
（1）本研究通过对包埋材料成分的选择和比例的调整发现，当焦磷酸钠占比为3%、六偏磷酸钠为1%、三聚磷酸钠为3%，蔗糖为2%时，可成功制备出一种抗冻融、机械强度高、受环境因素影响小的固定化颗粒。
（2）抗冻融固定化材料与产碱杆菌Y具有良好的匹配度。较游离菌相比，固定化产检杆菌在不同污染物浓度、pH、温度条件下，对恩诺沙星的去除能力有着长期稳定的显著提升。其中恩诺沙星浓度为0.5 mg/kg、温度为15 ℃、p H=8时，去除率提升效果最为显著。
（3）固定化产碱杆菌减小了低温对产碱杆菌降解抗生素的影响，即使在4 ℃条件下，固定化产碱杆菌对水中恩诺沙星的降解率较游离菌仍提高11.6%。这一发现具有重要的实际意义，为寒冷地区的污染修复提供了有效的技术手段。
（4）抗冻融固定化材料帮助产碱杆菌在冻融条件下中能够保持较高的活性，为恩诺沙星的降解提供了稳定的支撑。在保留了Y菌剂原有的耐低温特性的同时，进一步提升了其对恩诺沙星的降解能力，使其在面临冻融等不利环境条件时仍能保持较高的降解活性。
参考文献（略）
